Correzione dell’aploinsufficienza nella DBA tramite l’utilizzo di molecole SINEUP

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La Dott.ssa Dianzani a capo della ricerca insieme a Maria Elisabetta Villa di Fondazione DBA

Fondi richiesti: 100.000 €

Durata Progetto: 2 anni

In questo progetto ci proponiamo di correggere gli effetti dell’aploinsufficienza di una proteina ribosomale ​​(RP) nell’anemia di Diamond Blackfan (DBA) aumentando il livello della proteina carente. A questo scopo useremo l’innovativa tecnologia dei SINEUP, molecole in grado di aumentare la traduzione di un mRNA bersaglio [Carrieri, Nature, 2012] a un livello più fisiologico rispetto a quello ottenuto con altre strategie di terapia genica. Questo è importante soprattutto perchè un eccesso di RPL5 o RPL11 è dannoso per le cellule [Fumagalli, Nat Cell Biol, 2009].

Disegno dello studio e metodi

Testeremo la capacità dei SINEUP di correggere il fenotipo patologico dovuto a mutazioni in RPS19, RPL5 o RPL11. Abbiamo già prodotto linee linfoblastoidi (LCL) da 8 controlli sani e 11 pazienti DBA con mutazioni in questi geni. Le sequenze SINEUP sono state disegnate e clonate in un vettore pCCL che contiene una cassetta bidirezionale per l’espressione del SINEUP e del gene reporter GFP [Amendola, Nat Biotechnol 2005]. Le LCL saranno trasdotte con i vettori lentivirali (LV-SINEUP) e l’efficienza sarà monitorata dal rilevamento della GFP. Se necessario, le cellule trasdotte saranno selezionate in base all’espressione della GFP. Un controllo negativo con una sequenza scramble sarà incluso in ogni esperimento. Verranno analizzati i livelli di mRNA e proteina del gene difettivo. Gli effetti dei SINEUP sulla maturazione dell’rRNA saranno valutati utilizzando Northern blot e Bioanalyzer [Farrar, Am J Hematol, 2014]. Verranno anche studiati i processi biologici che si trovano alterati nella DBA, ad es. proliferazione, ciclo cellulare e attivazione di p53. Se il fenotipo patologico sarà corretto dai SINEUP, valideremo i nostri risultati in cellule primarie eritroidi. Useremo cellule CD34+ purificate da sangue cordonale di donatori sani e modificate con la tecnologia CRISPR/Cas9 per creare aploinsufficienza per RPS19, RPL5 o RPL11. Queste cellule saranno trasdotte con i LV-SINEUP e differenziate in senso eritroide. Studieremo il processamento dell’rRNA e l’attivazione di p53, come anche la capacità dei SINEUP di ripristinare la corretta differenziazione eritroide.

Risultati attesi e ricadute

Con questo progetto si valuterà la possibilità di correggere gli effetti della carenza di RP mediante l’uso dei SINEUP. Il nostro obiettivo è quello di fornire una dimostrazione che i SINEUP potrebbero rappresentare una nuova opzione terapeutica per la DBA.

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